氧化还原酶的活性测定在氧化应激、免疫防御和能量代谢研究中应用广泛。NOX 与 TrxR 虽然作用的底物不同，却都属于以还原型吡啶核苷酸为电子供体的氧化还原酶，并且都可以借助人工电子受体或显色底物，把电子传递过程转化为可见光区吸光度的变化，从而在普通分光光度计上完成动力学测定。
以下分别说明两种酶的催化特点、显色偶联机制与检测要点，并在最后对两者的异同作出对比，便于在实验设计时选择合适的测定体系。
一、NADH 氧化酶（NOX，EC 1.6.99.3）活性检测
NADH 氧化酶以 NADH 为电子供体，以分子氧为最终电子受体，把 NADH 氧化为 NAD⁺，同时将氧还原为过氧化氢或水。NAD⁺ 是糖酵解、三羧酸循环以及多种脱氢酶反应的必需辅酶，细胞内 NAD⁺/NADH 的比值直接影响代谢通量与氧化还原状态。NOX 通过不断再生 NAD⁺，在维持这一比值中发挥作用。
在动物免疫系统中，NOX 与吞噬细胞的呼吸爆发密切相关，参与活性氧的生成与病原体清除；在植物中，它与活性氧信号、抗病防御和程序性死亡过程有关。因此，测定 NOX 活性常用于评估组织的氧化还原状态与免疫反应水平。
NOX 催化 NADH 被氧气氧化生成 NAD⁺，该氧化过程释放的电子可通过中间递体传递给人工电子受体 2,6-二氯酚靛蓝（DCPIP），从而把 NADH 的氧化与 DCPIP 的还原偶联起来。
DCPIP 是一种蓝色的氧化还原指示剂，氧化态在 600 nm 处有强吸收，接受电子被还原后变为无色。因此，反应体系在 600 nm 处的吸光度随反应进行而下降，下降速率与酶活性成正比。连续监测该波长的吸光度变化，即可换算出 NADH 的氧化速率，进而计算 NOX 的活性大小。
DCPIP（氧化态，蓝色） + 2e⁻ + 2H⁺ ──▶ DCPIP-H₂（还原态，无色）
※ 600 nm 处：蓝色氧化态有强吸收，还原态几乎无吸收 → 表现为吸光度持续下降
反应通常在 pH 7.0～7.4 的磷酸钾缓冲液中进行，温度控制在 25 ℃ 或 37 ℃。DCPIP 对光敏感，需避光配制并现配现用，久置会自发褪色，抬高本底；NADH 溶液同样不稳定，应置于冰上并尽快使用。
NOX 以氧气为最终电子受体，反应体系需要保持氧气充足，过度密封或体系黏度过高都会限制反应速率。样本中若含有 DTT、GSH、抗坏血酸等还原性物质，会直接还原 DCPIP 造成假阳性，需要设置样本本底对照予以扣除。酶液加入量也应通过预实验确定，使每分钟吸光度下降落在合适区间内，保证速率处于线性阶段。
二、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性检测
TrxR 是一种含硒的二聚体黄素酶，活性中心同时包含 FAD 结构域与硒代半胱氨酸残基。它以 NADPH 为电子供体，把电子经 FAD 传递到活性中心的二硫键或硒硫键，再将底物上的二硫键还原。其天然底物是硫氧还蛋白，二者与 NADPH 共同构成硫氧还蛋白系统。
硫氧还蛋白系统参与抗氧化防御、DNA 合成、转录因子活性调控等多个过程。TrxR 还表现出与谷胱甘肽还原酶（GR）类似的活性，能够催化 GSSG 还原生成 GSH，因而与谷胱甘肽氧化还原循环相互交叉。在肿瘤、炎症和氧化应激相关研究中，TrxR 活性常作为反映细胞抗氧化能力的重要指标。
TrxR 以 NADPH 为电子供体，催化二硫键底物的还原。在体外检测中，常用 DTNB（5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)）作为底物：TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB，生成 TNB（5-硫代-2-硝基苯甲酸）与 NADP⁺。
TNB 呈黄色，在 412 nm 处有特征吸收峰，摩尔消光系数大，显色稳定。因此通过连续测定 412 nm 处吸光度的增加速率，即可反映 TNB 的生成速率，进而计算 TrxR 的活性。该显色体系灵敏度较高，适合微量样本的测定。
※ 412 nm 处：TNB 有强特征吸收 → 表现为吸光度持续上升
反应一般在 pH 7.0 左右的磷酸钾缓冲液中进行，缓冲液中常加入 EDTA 以螯合金属离子。DTNB 与 NADPH 都需现配现用、避光保存，否则本底上升速率会明显偏高，影响低活性样本的测定。
样本中的游离巯基（GSH、半胱氨酸、DTT 等）会直接与 DTNB 反应生成 TNB，造成假高值，需要通过不加 NADPH 的本底管予以扣除。血红蛋白等血红素蛋白在 412 nm 附近有强吸收，溶血样本会严重干扰测定，应尽量避免或另设样本空白。TrxR 为含硒酶，对氧化环境敏感，提取过程中需注意低温操作，缩短处理时间。反应速率同样应控制在线性范围内，吸光度上升过快时可将酶液稀释后重新测定。
三、两种方法要点对比
| 比较项目 | NOX（NADH 氧化酶） | TrxR（硫氧还蛋白还原酶） |
|---|---|---|
| 电子供体 | NADH | NADPH |
| 最终电子受体 | 分子氧 O₂ | 二硫键底物（DTNB） |
| 偶联显色剂 | DCPIP（蓝色，氧化态） | DTNB（生成 TNB） |
| 显色剂角色 | 人工电子受体，被还原 | 二硫键底物，被还原后释放 TNB |
| 检测波长 | 600 nm | 412 nm |
| 吸光度变化 | 随反应下降 | 随反应上升 |
| 摩尔消光系数 | 约 21.0 mM⁻¹·cm⁻¹ | 约 13.6 mM⁻¹·cm⁻¹ |
| 主要干扰 | 还原性物质直接褪色、光照、氧含量不足 | 游离巯基、溶血、NADPH 自发氧化 |
| 必设对照 | 不加酶液 / 灭活酶液 | 不加酶液 + 不加 NADPH 双对照 |
| 典型应用 | 氧化还原状态、免疫反应、NAD⁺ 再生研究 | 抗氧化能力、肿瘤与炎症相关研究 |
NOX 与 TrxR 的测定都把电子传递过程转化为吸光度的线性变化，区别在于前者以 DCPIP 作为人工电子受体、信号表现为下降，后者以 DTNB 作为二硫键底物、信号表现为上升。实验时按各自的波长和对照设置完成测定，再结合蛋白定量与适当稀释梯度，即可获得重复性较好的酶活数据，为氧化应激、免疫应答与代谢相关研究提供依据。
